近日，來自中國農業大學鄭浩課題團隊聯合清華大學邢新會教授、張翀教授團隊、華大智造研發團隊，在微生物學領域知名期刊Microbiome（IF= 19.4）上發表了題為“Identification of the mutual gliding locus as a factor for gut colonization in non-native bee hosts using the ARTP mutagenesis”的論文1，該研究利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術，構建了地熊蜂(Bombus terrestris)腸道細菌Snodgrassella的突變體文庫。

通過在無菌蜜蜂模型體內的連續傳代，追蹤了Snodgrassella菌株的適應性定殖過程，觀察到定殖能力增強的菌株在mglB基因中表現出顯著的遺傳變化，暗示其通過改變腸道菌IV型菌毛依賴性運動系統促進腸道菌的體內定殖。該研究中，針對單點突變位點的擴增子測序工作基于華大智造DNBSEQ-E25平臺完成，以用于快速高通量檢測腸道細菌的群落組成。

背景介紹

宿主腸道環境通常會對微生物帶來較強的選擇性壓力，促使細菌保持特定性狀以成功定殖，從而在長期共生過程中形成宿主特異性。識別宿主選擇的特征對于理解動物和共生微生物之間不斷發展的相互作用過程至關重要。

然而，當前的實驗方法主要集中在模式細菌上，如高突變大腸桿菌或通過宿主傳播而發生遺傳變化的野生菌株，無法全面揭示腸道微生物定殖和宿主特異性形成的過程，此研究利用ARTP誘變技術突破自發突變率低的限制，以便在溫和條件下研究腸道細菌的分子進化機制。

研究成果

01

ARTP誘導的特定突變可能導致Snodgrassella在非本地宿主中定殖

本研究利用ARTP技術構建了Snodgrassella communis B10998菌株的輸入突變體文庫，通過優化暴露時間實現了高突變率（圖1A，B）。為了探索促成定殖的遺傳機制，在非本地宿主意大利蜜蜂（A. mellifera）中評估了突變體的定殖潛力，盡管突變體整體定殖水平低于野生型，但高劑量接種（圖1C，D, E）和連續傳代可提高其在宿主中的定殖能力（圖1 F，G），暗示著突變可能有助于S. communis菌株提升在非本地宿主中的競爭優勢。

圖1. ARTP處理獲得的Snodgrassella communis突變體在非本地宿主中的定殖

02

Snodgrassella菌株腸道定殖的潛在突變

通過研究在無菌蜜蜂模型體內連續傳代下不同菌株基因的突變數量和頻率（圖2A），發現突變數量和平均突變頻率并無顯著變化。為了進一步評估不同蜂群中的突變模式，使用SnpEff工具對變異類型和功能進行了注釋，發現SNPs是最普遍的突變類型，而插入突變只在D10組中發現（圖2C），大多數突變為錯義突變，可能會影響基因表達或蛋白質活性（圖2D）。這些結果表明，Snodgrassella菌株腸道定殖的遺傳變異在連續傳代過程中保持穩定，突變的頻率和模式沒有顯著變化。

圖2. 體內傳代過程中細菌的突變特征

03

mglB突變使細菌在非本地宿主中具有競爭優勢

通過分析實驗過程中出現的基因突變位置和頻率，發現大部分的突變頻率在5%到20%之間，并且沒有特定的基因組位置偏向。特別地，rpsG和glcA突變在傳代過程中以100%的頻率保留下來（圖3A）。此外，mglB點突變的頻率在譜系2（P1L2）的第1代中僅為6.9%，但在第2代中迅速上升至100%，并在第3代中保持不變（圖3B），這表明mglB突變可能為微生物腸道定殖帶來競爭優勢，通過PCR（圖3C）和測序實驗驗證了這些突變的存在和頻率，結果與預測結果高度一致。

圖3 mglB中發生的點突變可能帶來競爭優勢

04

Snodgrassella菌株中的mgl操縱子

MglB是mgl操縱子的關鍵組成部分，對調節細菌的運動性至關重要。研究發現，從蜜蜂和大黃蜂中分離的S. communis菌株都發現了mgl操縱子，所有蜜蜂腸道S. communis菌株均含有三個mglB基因(圖4A，B)。同時進一步確定了第3組中mgl操縱子的排列（圖4C），表明mglB基因可能經歷了重復或水平轉移。

圖4. Snodgrassella中的mgl操縱子

05

mglB的突變增強了適應性優勢

研究人員探討了S. communis菌株中mglB基因的錯義突變對表型的影響，先前的研究表明，mglB基因在調節IV型菌毛依賴性細胞運動中起著重要作用，ΔmglB細胞會表現出改變的菌落形態和滑行運動能力。在菌落擴增試驗中，SA01065突變體在0.5%瓊脂上表現出與其他菌株完全不同的形態，形成了密集的樹枝狀結構，遍布培養基表面（圖5E-F），這表明其細胞運動能力發生了改變，進一步強調了mglB中發現的突變會影響細胞運動能力。

研究團隊還通過競爭實驗探究了mglB基因突變對細菌在西方蜜蜂（A. mellifera）和地熊蜂（B. terrestris）宿主中的腸道定殖能力的影響。結果顯示，即使在數量上處于劣勢，SA01065突變體在蜜蜂宿主中仍能成功定殖（圖5G，H），并且可以克服巨大的數量劣勢并顯著勝過背景突變體(SA01065')和野生型（WT）。

然而，在地熊蜂（B. terrestris）宿主中，即使SA01065突變體在接種物中的比例更高，SA01065'和野生型（WT）仍占據主導地位。此外還利用DNBSEQ-E25對擴增子進行測序確認了群落組成，結果與桑格測序一致，證實了SA01065突變體在非本地蜜蜂宿主西方蜜蜂（A. mellifera）中定殖的競爭優勢，而在本地蜜蜂宿主地熊蜂（B. terrestris）中定殖的競爭優勢并不明顯。

圖5. mglB突變會影響細胞運動能力和體內競爭優勢

總結

本研究通過ARTP誘變技術獲得腸道共生細菌突變體文庫，并探究了這些變異基因在促進腸道細菌在蜜蜂宿主中定殖的分子機制，為未來研究腸道微生物和宿主的互作機制提供了新思路。其間，利用華大智造DNBSEQ-E25完成了部分腸道細菌群落檢測實驗，數據量充足，數據質量較高且與sanger測序結果一致。

DNBSEQ-E25是一款小巧輕便的基因測序儀，儀器占桌面積僅0.1 m2，運行速度快，對實驗室環境要求低，安裝、維護簡便，大大降低了測序的門檻，適合開展病原微生物檢測、宏基因組測序等應用。用戶可根據研究對象選取擴增區域，設計引物進行擴增，再利用華大智造MGIEasy DNA文庫制備試劑盒完成從擴增產物到測序文庫制備的全流程，接頭連接、文庫擴增及一步法DNB制備的過程僅需3小時。

多重PCR擴增技術與高通量測序技術的融合，能夠對樣本中的微生物群落進行全面而深入的分析，為研究者提供強大的工具，以全面探索和理解微生物在健康、疾病以及生態系統中的作用。

參考文獻：Meng Y, Zhang X, Zhai Y, et al. Identification of the mutual gliding locus as a factor for gut colonization in non-native bee hosts using the ARTP mutagenesis[J]. Microbiome, 2024, 12(1): 93.