單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)由于其在解析細(xì)胞異質(zhì)性方面的突出優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于基礎(chǔ)科研和醫(yī)學(xué)研究，該技術(shù)對(duì)測(cè)序通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量有著較高要求。作為主流高通量測(cè)序平臺(tái)的代表，華大智造MGISEQ-2000在單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用領(lǐng)域中的測(cè)序表現(xiàn)受到業(yè)界關(guān)注。

高通量測(cè)序是在臨床和科研應(yīng)用中進(jìn)行基因組學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)。本次測(cè)評(píng)通過在華大智造MGISEQ-2000和Vendor X兩種測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行Tapestri單細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)測(cè)序，比較兩種測(cè)序平臺(tái)對(duì)兩種細(xì)胞系以約3:1比例混合的細(xì)胞中分析單細(xì)胞基因型和表型的能力。結(jié)果顯示，兩種測(cè)序平臺(tái)在單細(xì)胞分析的每個(gè)級(jí)別（一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)分析）都具有高度一致性。這表明，華大智造MGISEQ-2000測(cè)序平臺(tái)可以用于使用Tapestri平臺(tái)單細(xì)胞DNA變異和蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析。

測(cè)評(píng)方案

本次測(cè)評(píng)研究使用MGISEQ-2000測(cè)序儀和Vendor X測(cè)序平臺(tái)對(duì)Tapestri單細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)文庫進(jìn)行了測(cè)序（圖1）。文庫是從K562和RAJI細(xì)胞的3:1混合細(xì)胞中生成的，使用目錄化MYE Panel，該P(yáng)anel涵蓋兩種細(xì)胞系特有的遺傳變異，研究中還按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序添加針對(duì)蛋白表達(dá)檢測(cè)的TotalSeq-D Heme Oncology Cocktail。基于華大智造MGISEQ-2000的測(cè)序?qū)嶒?yàn)在華大智造武漢客戶體驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

圖1. 實(shí)驗(yàn)流程示意圖

測(cè)評(píng)結(jié)果表1總結(jié)了測(cè)序后利用Tapestri Pipeline和Tapestri Insights進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析獲得的關(guān)鍵性能指標(biāo)。總體而言，這些指標(biāo)在兩個(gè)平臺(tái)上高度一致。兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)都產(chǎn)生了足夠數(shù)量的總讀序?qū)Γ瑥亩軌驗(yàn)橄掠畏治鎏峁?qiáng)大的單細(xì)胞基因分型和表型分析。調(diào)用的細(xì)胞數(shù)量和Panel均一性在兩個(gè)平臺(tái)上也相當(dāng)。此外，當(dāng)使用Tapestri Pipeline處理數(shù)據(jù)時(shí)，華大智造測(cè)序平臺(tái)的等位基因丟失率僅為6.7%，其關(guān)鍵性能指標(biāo)再現(xiàn)了MYE Panel數(shù)據(jù)表1中呈現(xiàn)的指標(biāo)，表明華大智造MGISEQ-2000適合對(duì)Tapestri單細(xì)胞文庫進(jìn)行測(cè)序。

表1. 一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)分析結(jié)果比較

為了確定每個(gè)平臺(tái)是否可以成功識(shí)別細(xì)胞系及其各自的遺傳變異，本次研究對(duì)數(shù)據(jù)（基因型）進(jìn)行聚類并通過熱圖將其可視化（圖2）。該分析揭示了兩個(gè)細(xì)胞群，K562細(xì)胞和RAJI細(xì)胞，比例約為3.5：1，在輸入細(xì)胞比例的預(yù)期范圍內(nèi)。在兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)上（圖2A和2B），兩個(gè)群體都以高度可比的比例被輕松鑒定。使用四個(gè)不同基因（TET2，SETBP1，CLB，KIT）的細(xì)胞系特異性變異確認(rèn)了這些細(xì)胞群體的身份。所有四個(gè)變體的總體突變分布在兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)之間顯示出相同的模式，從而顯示出成功調(diào)用單細(xì)胞基因型方面的相同性能。

圖2.使用選定突變的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行分層聚類

（A）在Vendor X平臺(tái)上根據(jù)細(xì)胞系特異性突變的四個(gè)變體（列）對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行聚類后的熱圖，得到K562和RAJI細(xì)胞~3.5：1分離和鑒定。（B）在MGISEQ-2000上根據(jù)細(xì)胞系特異性突變的四個(gè)變體（列）對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行聚類后的熱圖，得到K562和RAJI細(xì)胞的~3.5：1分離和鑒定。

除了基因分型數(shù)據(jù)外，蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)上也表明兩種測(cè)序平臺(tái)具有高度一致性。在已知在RAJI和K562細(xì)胞中差異表達(dá)的選定數(shù)量的譜系標(biāo)記物上，以~1:3的比例檢測(cè)到兩種細(xì)胞系（圖3）。具體而言，檢測(cè)到CD30在K562細(xì)胞中高表達(dá)，在RAJI中很難被檢測(cè)到，而HLA_DR、B細(xì)胞標(biāo)志物CD19和CD38在B淋巴細(xì)胞系RAJI中高表達(dá)，在K562中檢測(cè)不到。CD71在兩種細(xì)胞系中均有表達(dá)，但在K562細(xì)胞中與RAJI相比顯著更高。

圖3. 區(qū)分K562和RAJI細(xì)胞的單細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)

注：已知在兩個(gè)細(xì)胞系中差異表達(dá)的五個(gè)標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)的分層聚類1-3。兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)上基于細(xì)胞條形碼整合后的數(shù)據(jù)聚（左）或分別基于兩臺(tái)測(cè)序儀的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（右）。

最后，利用標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行UMAP降維聚類，結(jié)果證實(shí)兩種測(cè)序平臺(tái)上兩種細(xì)胞系被成功鑒定和分離（圖4A），并在整合基因分型數(shù)據(jù)時(shí)確認(rèn)兩組不同的細(xì)胞分別屬于RAJI或K562（圖4B）。

4. 可視化結(jié)果整合圖（A）基于標(biāo)準(zhǔn)化后的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行UMAP分析在兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)（左）或單個(gè)平臺(tái)（右）中所有細(xì)胞的聚類情況，顏色代表不同的測(cè)序平臺(tái)（左）或不同細(xì)胞系（右）。（B）基于四種選定細(xì)胞系特異性變異的等位基因頻率（VAF）繪制其在UMAP圖上的投影。

測(cè)評(píng)總結(jié)

華大智造MGISEQ-2000高通量測(cè)序平臺(tái)在Tapestri細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)文庫測(cè)序中表現(xiàn)穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的DNA變異鑒定、蛋白質(zhì)表達(dá)水平定量和亞克隆鑒定，可滿足用戶的各項(xiàng)需求。同時(shí)，依托其快速、靈活、高通量的平臺(tái)優(yōu)勢(shì)，華大智造MGISEQ-2000廣泛適用于全基因組測(cè)序、超深度外顯子組測(cè)序、表觀基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和腫瘤Panel等大型測(cè)序項(xiàng)目。

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