隨著疫情進入攻堅階段，基于實時熒光RT-PCR法的核酸檢測技術在新冠病毒快速鑒定及確診中發揮了重要作用。然而，若要對新冠病毒來源、變異進化及致病機理等進行研究，需獲取完整的病毒基因組信息，這離不開高通量測序和病毒序列組裝。

為全面深入地揭示新冠病毒的相關特性，華大智造可為新型冠狀病毒高通量測序、序列組裝、變異進化分析等流程提供一體化產品組合，并已協助全國多地疾控中心成功組裝新型冠狀病毒全長序列。結果顯示，它們與公布的參考基因組序列高度一致。

新冠病毒序列組裝過程中的難點及要求

如大家所知，高通量測序在新冠病毒鑒定及診斷中可與RT-PCR法形成互補，不僅能提高陽性檢出率，還能進行并發檢測，提供更多可能感染的病原信息。更為重要的是，它還可以對病毒序列進行組裝，獲得病毒全長基因組信息，為追溯病毒來源、監測病毒變異趨勢、探究致病機理提供研究基礎。

為獲取完整的病毒基因組序列，目前廣泛應用的高通量測序技術是將核酸序列打斷成短片段進行測序，然后通過分析軟件將測得的短序列進行拼接組裝。然而，新型冠狀病毒作為一種新發病毒，人們在測序深度、測序準確性、重復序列比例等方面，還沒有形成具有參考意義的經驗值。如果要將海量的短序列還原出原始的基因組序列，則會在序列拼接中出現以下問題：

首先，難免出現測序錯誤，導致某些重疊可信度低；其次，基因組序列的不完全覆蓋性以及高重復序列的干擾，會影響拼接的準確性和完整性；最后，宏轉錄組測序樣本中的人源序列占85%以上，病原序列僅占5%左右，這使得病毒基因組序列拼接難度更高。

圖1 序列拼接組裝難點及其對測序產品的要求

優化測序策略，確保病毒序列信息完整性

為破解上述新冠病毒序列在組裝過程中遇到的難題，華大智造可提供含建庫、高通量測序、序列組裝、變異進化分析等流程在內的一體化產品組合。

在建庫環節中，為避免樣本在采樣、保存和運輸過程中因不確定性導致提取的核酸含量出現較大差異，華大智造可提供兩種產品組合：一是對核酸含量高的樣本建議進行rRNA去除再建庫，提高有效數據占比；二是對核酸含量低的樣本，直接進行RNA建庫，減少核酸損失，提升建庫成功率，并加大測序深度。

其次，在測序環節采用華大智造MGISEQ-200測序儀，它不僅小巧靈活，同時高效專注，已協助全國多地疾控中心完成鑒定并成功拼接出各地首例新冠病毒序列。

最后，通過病原鑒定系統對新冠病毒序列進行數據分析并采用IDBA方法完成拼接。

這樣，即使是在未去除宿主的情況下，也可以滿足宏轉錄組測序病毒序列組裝對數據量的要求，保證序列信息的完整性。

圖2 針對新型冠狀病毒序列組裝的產品組合與策略

實例解析新冠病毒全基因組序列獲取全流程

接下來，我們將以某疾控中心收到的1例新冠病毒肺炎疑似樣本為例，為您解析該CDC首例新型冠狀病毒感染病例呼吸道標本宏轉錄組測序及病毒序列組裝全流程：

新冠病毒全基因組序列獲取全流程

2020年1月20日 - 1月22日上午

1月20日，文庫制備

針對核酸量不同的樣本，團隊分別采用了不同的建庫策略，并使用MGIEasy RNA文庫制備試劑套裝進行建庫。經反轉錄、接頭連接、PCR擴增、純化等一系列操作后獲得文庫產物，再使用滾環擴增技術，制備DNA納米球。

圖4 MGIEasy RNA文庫制備試劑套裝

1月21日，上機測序

基于MGISEQ-200平臺，對該地發現的首例病例的呼吸道標本進行300M的高深度測序。

1月22日上午，數據分析

產出32Gb數據，總reads數318M。結合病原感染快速鑒定系統，鑒定出2,337,442條新型冠狀病毒reads。

1月22日上午，拼接組裝

分析軟件自動將2,337,442條的新型冠狀病毒reads從所有序列中抽出。使用拼接效率高的IDBA方法進行組裝，成功完成新型冠狀病毒的序列組裝，獲得基因組序列全長29.9kb。

知己知彼，百戰不殆。盡管我們對新型冠狀病毒的認識有待進一步研究，但通過宏轉錄組測序和病毒序列組裝獲得新型冠狀病毒全基因組序列，有助于揭示病毒相關特性。通過對全基因組序列相似性比較和變異位點分析，可以為構建進化圖譜、追溯病毒來源、追蹤變異路徑、了解致病機理等提供重要參考信息，助力抗擊疫情。