對于靶向測序數據的評估，覆蓋均一性是最為重要的參數之一，它決定了有多少目標區域能夠達到分析要求，平均測序深度提高還不足以解決目標測序區域能夠覆蓋的問題，最終目標區域的覆蓋情況還是取決于覆蓋均一性。

國產測序儀

均一性表現大大超出預期

通過華大智造DNBSEQ-T7測序平臺上進行的大量測評工作，伯科生物科技有限公司（簡稱“伯科”）自主研發生產的全外顯子Panel，TargetCap? Core Exome Panel v3.0，性能表現已經達到了國際一流產品標準，尤其是在覆蓋均一性方面表現卓越。

華大智造DNBSEQ-T7基因測序儀

如圖1所示，在測序5Gb的情況下，Core Exome Panel v3.0與DNBSEQ-T7測序平臺的組合表現，≥20x的區域已經高達98.7%，大大超出了預期。

圖1. TargetCap? Core Exome Panel v3.0在不同測序深度下的均一性表現

覆蓋均一性決定了有多少目標區域能夠達到分析要求。換言之，高均一性能夠減少測序數據量，節約成本（圖2A）。如圖2B所示，伯科TargetCap? Core Exome Panel v3.0與MGISEQ-2000測序平臺的組合表現出，當測序7.5Gb時（101X），≥20X以上的目標區域占比達到99.6%；當測序5Gb時（68X）, ≥20X以上的目標區域占比仍然超過98%，遠高于國標《GB/T 37872-2019》規定的80%。

圖2. 高均一性可有效節約測序數據量

此外，伯科為用戶提供定制化基因Panel在華大智造測序平臺上面表現如表1所示，對于不同大小的基因Panel，在0.2x平均深度方面，可以達到99.5%以上，在0.5x平均深度可以達到95%以上，Fold80可達1.4以下，總體上，定制基因Panel表現出極高的均一性。

表1. 伯科定制化基因Panel在華大智造測序平臺的性能表現

如此優秀的均一性

國產panel是怎么做到的？

通過伯科的研發團隊發現，TargetCap? Core Exome Panel v3.0開發中確實有一些“黑科技“。

2.1 獨創的局部探針濃度調整

在影響覆蓋均一性的因素中，目標區域GC含量最為關鍵，通過對低/高GC區域的局部探針濃度調整可以優化Panel的覆蓋偏好。但是，除了GC含量，還有一個鮮為人知的關鍵因素-探針補償效應。伯科研發團隊對引起覆蓋偏好的因素進行聚類分析時發現，目標區域所覆蓋的探針數量的多少，與其覆蓋深度正相關，也就是說探針之間的側翼補償效應會引起覆蓋偏好，其原理如圖3所示。

圖3. 探針側翼補償效應產生覆蓋偏好示意圖

按照目標區域覆蓋探針數量的多少，我們把目標區域分為低、中、高補償區（L-FLK、M-FLK和H-FLK），以及低、中、高GC區域分別對~1.5萬條探針組成的Panel進行統計。

如圖4所示，目標區域的覆蓋深度與其探針數量正相關，也就是說，長短不一的目標區域會因覆蓋探針的多少而產生天然的深度差異，其與GC偏好一樣，是影響Panel覆蓋的重要因素。

圖4. GC含量和探針補償效應對覆蓋深度的影響

那么，調整L/M/H-FLK這3種區域的局部探針濃度，能否改善Panel的覆蓋偏好呢？

為了驗證這一假設，研發人員合成了L/M/H-FLK區域探針不同濃度配比的Panel，并進行捕獲測序。

如圖5所示，濃度配比2#的三個區域之間的覆蓋差異最小，數據表現也最優，與比例1#相比，Fold 80降低0.1（SNP等位基因頻率并未受到影響），證明探針補償效應也是影響覆蓋均一性的重要因素，調節補償效應區域探針濃度是優化Panel均一性的有效手段。

圖5. 調整不同探針補償區的探針配比對覆蓋均一性的影響

在此基礎之上，再對GC偏好區域的探針局部濃度進行調整，也能使Fold80降低0.1，進一步表明探針補償效應是獨立于GC的覆蓋偏好影響因子（圖6）。

圖6. 調整不同GC含量目標區域探針配比對覆蓋均一性的影響

綜上所述，針對覆蓋偏好的關鍵影響因子探針補償效應和GC含量，調整對應的探針濃度，可以明顯改善Panel的覆蓋均一性（圖7）。

圖7. 伯科生物自主研發的覆蓋偏好優化技術原理示意圖

2.2 自主知識產權的生物素修飾

在WES Panel的開發過程中，除了使用伯科獨創的局部探針濃度調整技術，TargetCap? Core Exome Panel v3.0還采用伯科自主知識產權的專利生物素修飾。分別采用伯科自主知識產權的生物素與常規生物素分別制備Core Exome Panel v3.0，并進行捕獲測序。

結果顯示，與常規生物素相比，伯科自主知識產權的生物素能夠進一步提升覆蓋均一性（圖8）。除此之外，通過加入多種小分子化合物，伯科自主研發的雜交試劑能夠進一步降低GC偏好。

圖8. 伯科生物素與常規生物素修飾的Core Exome Panel v3.0比較

綜上所述，從雜交試劑、探針修飾/合成/設計、探針局部濃度調整等多方面測試優化調整，所謂“積跬步至千里“，每一步1%的提升積累，使得TargetCap? Core Exome Panel v3.0的覆蓋均一性在眾多競品中脫穎而出。