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在第二期智造微課中，PCR-Free技術在DNBSEQ平臺的應用表現大放異彩。其中到底有何玄機，本文將做簡單介紹。

為什么需要PCR-Free技術

在高通量測序中，之所以引入PCR方法，是為了對微量DNA樣本進行擴增，提高文庫產量，放大DNA熒光信號，提高測序準確度。但是PCR在帶來一些好處的同時，也會帶來一些問題。例如，PCR聚合酶有一定的比例會引入錯誤，然后通過PCR, 這些引入的錯誤會持續累積下來，造成假陽性的變異，難以區分和識別。此外，PCR聚合酶具有一定的擴增偏向性，一些區域，尤其是高GC或者低GC，二級結構等區域，擴增效率低，難以覆蓋到；還會引入大量錯誤的InDel；同時帶來大量的Duplication，造成DNA數據量的浪費，增加測序成本。

因此，我們需要PCR-Free技術：既能具備PCR的優勢，也能克服PCR的缺點，能夠帶來高質量的文庫，不僅具備高靈敏度、能夠實現微量樣本的檢測，而且具備高準確性、能夠減少后續變異研究的驗證工作量。

PCR-Free技術原理

基于華大智造DNBSEQ平臺的PCR-Free技術，在建庫和測序過程中均沒有PCR錯誤，將無擴增錯誤的PCR-Free單鏈環狀文庫建庫方法與無拷貝錯誤累積的DNB制備方法結合起來，可以全面覆蓋基因組的復雜區域，檢測更精準，能夠有效避免PCR擴增引入的堿基錯配和偏向性。基于該技術，華大智造現已推出MGIEasy? PCR-Free文庫制備試劑套裝（物理打斷法）和MGIEasy? 酶切PCR-Free文庫制備試劑套裝（酶切法），樣本兼容性好，支持自動化建庫（適配華大智造MGISP系列自動化平臺）。

PCR-Free技術優勢

基于華大智造DNBSEQ平臺的PCR-Free技術，經過自主研發和升級優化，其整體優勢可以概括為低投入，高產出。

首先，在樣本起始量方面，相較于其他平臺PCR-Free方法的起始量要求，MGIEasy? PCR-Free文庫制備試劑套裝（物理打斷法）和MGIEasy? 酶切PCR-Free文庫制備試劑套裝（酶切法）對起始量的要求都是最低的（50-1000ng之間），而且能夠保證高質量的文庫產出。

其次，基于華大智造DNBSEQ平臺的PCR-Free技術具備低InDel假陽/假陰率，高準確度的優勢：基于MGISEQ-2000平臺的PCR-Free ,可以實現99.9%的SNP檢測精度及99%的InDel檢測準確性。

最后，基于華大智造DNBSEQ平臺的PCR-Free技術具備低深度，高靈敏度的優勢：在4X、6X、8X、10X測序深度下，基于DNBSEQ平臺SNP的靈敏度更高。

PCR-Free數據展示

以發表在bioRxiv的預印文章Advanced Whole Genome Sequencing Using a Complete PCR-free Massively Parallel Sequencing (MPS) Workflow為參考，通過對比PCR-Free基于不同測序平臺的數據表現，結果顯示：基于DNBSEQ 平臺的MGIEasy? PCR-Free數據相較于NovaSeq平臺的MGIEasy? PCR-Free數據及TruSeq? DNA PCR-Free數據質量更優，尤其在Duplicate Rate以及InDel方面更具有顯著優勢。

文章同時對比了在15X及30X測序深度下，PCR與PCR-Free基于不同測序平臺的數據，結果顯示基于DNBSEQ平臺的 15X PCR-Free測序數據與30X PCR-Free的結果一致，這一對比說明：全基因組測序要求大量的數據，大部分是因為測序錯誤高、重復序列高、覆蓋度不均一等問題需要數據量來進行修復，這就提高了測序的成本。而通過DNBSEQ平臺的低深度PCR-free文庫就可以達到其他平臺高深度PCR文庫相同水準的測序結果，從而大大降低了成本。

PCR-Free應用領域 

基于華大智造DNBSEQ平臺的PCR-Free技術，以其低投入、高產出的優勢，在組學研究和臨床應用的多個領域具有應用價值。

以群體基因組學研究為例，結合MGISP-960自動化建庫儀以及DNBSEQ-T7測序儀，可以實現年通量一萬人以上的高深度WGS檢出。相較于其他產品，基于華大智造DNBSEQ平臺的PCR-Free技術對人群樣本的起始量要求更低。

針對動植物基因組學研究，基于DNBSEQ平臺的PCR-Free方法的突出優勢是對高低GC物種，無擴增偏好性。除了人類樣本，動植物中存在很多不同GC含量的物種，至少40%的物種的基因組GC含量偏高或者偏低，例如褐潮藻類和小球藻，GC含量高達65%以上；線蟲等不到30%。對于這些GC含量偏高或者偏低的基因組，常規的PCR技術存在明顯的擴增偏好性，難以很好地覆蓋基因組。而PCR-Free方法可以讓不同GC含量的物種均具有較好的基因組覆蓋均一性。同時，如果選擇在DNBSEQ-T7測序平臺展開該產品的應用，則兼備超高通量的成本優勢和時間優勢。