近日，國家衛健委發布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》。新版診療方案主要調整了以下內容：防疫形勢提示警惕境外輸入病例；傳播途徑增加“應注意糞便及尿對環境污染造成氣溶膠或接觸傳播”；增加對孕產婦和兒童的臨床表現描述；增加疑似病例排除標準……其中，診斷標準在已有的兩種實驗室檢測方法（RT-PCR核酸檢測和病毒基因測序）的基礎上，新增“血清新型冠狀病毒特異性lgM和lgG抗體作為病原學診斷標準之一”。

關于指南中提出的這幾種方法，它們之間到底有怎樣的差異，在實際應用中需要哪些工具和平臺才能夠順利展開檢測呢？我們一起來了解：

探究新冠病毒檢測方法

方法1：實時熒光RT-PCR檢測

實時熒光RT-PCR的特點是非常快速，其檢測原理是針對要識別病毒的特異性核酸序列，設計特定的引物和探針。目前市場上的試劑盒大多都是識別RdRp基因，即圍繞病毒核酸復制表達那一部分的基因設計探針。

在實時熒光RT-PCR的復制過程中，通過探針識別出病毒的這一部分序列，然后通過PCR將病毒的序列復制放大，在放大的過程中，在反應體系中加入染料，并實時捕獲信號，最后通過qPCR附帶的軟件來計算Ct值，用于檢測結果分析。

理論上這種方法非常靈敏，只要有一個病毒的核酸被識別出來，就都可以被放大，這個過程循環數越小，曲線提升越明顯，意味著病毒的載量越高，所以是一種目的性非常強的特異性的方法。

方法2：病毒基因測序

如果說熒光RT-PCR方法像是在池塘里釣魚，那么對樣本進行宏基因組測序就類似于用一張大網將池塘中所有的魚一網撈盡，把樣本中人類的基因、病毒基因和其他微生物的基因都識別出來。

宏基因組測序方法檢測更全面，敏感度高，特別是對于多重感染，如肺炎患者可能還同時感染甲型、乙型流感、支原體、鼻病毒等，也能通過宏基因組測序識別出來，但全流程時間比RT-PCR方法更長一些。此外，在病毒載量低于RT-PCR最低檢出限及人源宿主背景較低的情況下，也可以通過高深度的測序來實現特異性的識別。

此外，還可以基于多重PCR靶向Panel的高通量測序方法獲取SARS-CoV-2病毒全長基因組。這種方法可以在高通量測序的同時完成多個靶標的檢測。

具體流程上，測序方法是在提取核酸之后，進行文庫制備，隨后進入測序儀測序得到序列信息，經過背景數據過濾后，將其比對到數據庫上，從而獲取病毒完整的reads，最后組裝成完整的基因組序列。

圖1  華大智造DNBSEQ-T7在1月3日完成新冠病毒全基因組序列組裝

方法3：血清學檢查

血清學檢查方法，操作簡單方便，最快15分鐘內出結果。但試劑靈敏度和特異性還比較有限，適用于大量疑似病例和無癥狀感染者檢測。因此目前我國在抗疫中廣泛采用的是核酸檢測。

熒光RT-PCR、高通量測序和血清學檢查這三種方法各有側重，不能相互替代。將多種檢測方法聯合應用，可有效縮短檢測窗口期，提高陽性檢出率。

盤點新冠病毒檢測方法 

圍繞新冠病毒的實驗室檢測方法，下面我們從一站式、自動化和高通量等幾個層面展開探討。

熒光RT-PCR核酸檢測與高通量測序這兩種方法比較類似：實驗室接收到樣本之后，都要先對樣本進行滅活處理，然后使用提取試劑盒提取出樣本的核酸，根據不同的檢測方式，RT-PCR會做反應體系的配置，而高通量測序則有文庫制備的過程，接下來就進入各自的儀器，進行核酸序列的檢測，隨后系統會進行自動化的判定和結果輸出。

其中，兩種方法的樣本提取、體系配置或建庫等這些中間步驟的手工操作過程，都可以用自動化設備來完成，且更安全更快速。

圖2  華大智造新冠病毒實驗室產品

不同檢測流程如何配置設備

那么具體到不同檢測流程，如何配置實驗室設備呢？以華大智造為例：

對于RT-PCR的檢測方法，一臺MGISP-960一小時處理96個樣本核酸提取（目前已升級到80分鐘處理192個樣本），理論上一天8小時可以處理500-1000例樣本；而常見熒光PCR儀以平均12小時處理700例樣本估算，兩臺設備可采用1:1配置。同時華大智造也提供適配的試劑盒，包括核酸提取試劑盒以及熒光PCR體系配置的核酸檢測試劑盒，可穩定實現至少每天500例的樣本處理能力。

表1  RT-PCR核酸檢測實驗室設備，500-1000例樣本/天

對于高通量測序（宏基因組）檢測方法，該方法檢測樣本量的限制主要是基因測序儀。以目前華大智造通量最大的DNBSEQ-T7為例，1天可以處理最多128例樣本（數據量＞80M reads），因此上游可以配置4臺MGISP-100或2臺MGISP-960，完成從提取到建庫的自動化流程，適配試劑盒可整套一起打包。

表2  高通量測序實驗室設備，100-200例樣本/天

對于高通量測序（靶向）檢測方法，其原理是自動化提取+多重PCR靶向測序。不同于一網打盡的宏基因組測序，這種方法通過針對新冠病毒的特殊檢測試劑盒，在測序前的樣本制備中，先把新冠病毒的基因撈出來，然后再進行測序。這種方法兼具宏基因組測序和RT-PCR的優點，在得到病毒基因組全序列的同時，測序樣本量可以提高10-20倍。

圖3  華大智造新冠病毒檢測試劑盒（多重PCR測序Panel）

在此基礎上，通過內參還可以相對定量地判斷病毒載量，更加適用于大量樣本情況下的疫情檢測和病毒變化的統計學分析研究。目前，華大智造已推出基于該方法的檢測試劑盒（即多重PCR測序Panel）。