在腫瘤高通量測(cè)序應(yīng)用中，可衍生出三種常見方案：腫瘤Panel、全外顯子（WES）和全基因組（WGS）。其中，全外顯子是一種針對(duì)人類基因的外顯子進(jìn)行檢測(cè)的方法，在臨床應(yīng)用上還具有諸多優(yōu)勢(shì)。

作為腫瘤突變負(fù)荷（TMB）檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，WES可為腫瘤免疫治療選擇提供依據(jù)。此外，它能為腫瘤微小殘留病（MRD）檢測(cè)提供突變信息，讓變異標(biāo)志物的選擇更加游刃有余，為腫瘤治療方案評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)控等提供更多參考；還可以通過構(gòu)建患者個(gè)體的全外突變譜，在個(gè)性化腫瘤疫苗制備中，篩選更為有效的新生抗原。

之所以選擇WES，是由于與全基因組測(cè)序（WGS）相比，其位點(diǎn)數(shù)僅為1%，卻覆蓋了大部分基因組編碼區(qū)，還可以靈活添加其他區(qū)域，例如線粒體、CNV和病毒模塊等。因此，WES是一種相對(duì)簡(jiǎn)便、快速的診斷方案，也被認(rèn)為是目前臨床應(yīng)用中最具性價(jià)比的基因檢測(cè)技術(shù)之一。

而與固定的panel相比，腫瘤異質(zhì)性與Panel基因固定的矛盾很難” One Size Fits All”（圖1）。隨著測(cè)序平臺(tái)國(guó)產(chǎn)化趨勢(shì)越來越明顯，測(cè)序成本大幅下降，WES在腫瘤臨床的應(yīng)用也越來越廣泛。

圖1. 上圖：50例NSCLS患者體細(xì)胞突變重合比例（TCGA）[1] 。下圖：WES檢測(cè)到的突變基因與商品化Panel基因List的重合基因數(shù)量。上方Panel，10例NSCLC隊(duì)列數(shù)據(jù)；下方Panel，1059例NSCLC TCGA數(shù)據(jù)；紅色方框?yàn)楦鶕?jù)WES突變譜設(shè)計(jì)的個(gè)性化Panel，藍(lán)色方框是固定基因的商品化Panel[1]。

作為國(guó)內(nèi)靶向捕獲技術(shù)的佼佼者，伯科生物對(duì)其設(shè)計(jì)與生產(chǎn)的當(dāng)家WES panel（TargetCap Core Exome Panel v3.0）進(jìn)行了全面測(cè)評(píng)，并評(píng)估了其在華大智造（MGI）測(cè)序平臺(tái)的數(shù)據(jù)表現(xiàn)。

結(jié)果顯示，華大智造測(cè)序平臺(tái)的表現(xiàn)超出預(yù)期。下文將闡述測(cè)評(píng)數(shù)據(jù)質(zhì)量、覆蓋度等方面的質(zhì)量指標(biāo)，變異結(jié)果將在下篇進(jìn)行展示。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1 WES Panel：伯科生物自主研發(fā)生產(chǎn)的TargetCap Core Exome Panel v3.0，由近40萬條120nt ssDNA探針組成。

2 樣本：采用含有不同突變數(shù)量的5套TMB gDNA標(biāo)準(zhǔn)品（Set 1-5），每套標(biāo)準(zhǔn)品由不同等位基因頻率的5個(gè)樣本組成（0%-40%），共25例樣本，按照樣本質(zhì)量的高低分為兩類，分別為稍低質(zhì)量樣本（LQ，15例）和高質(zhì)量樣本（HQ，10例）。

3 建庫與測(cè)序：對(duì)上述25例樣本構(gòu)建華大智造平臺(tái)的雙端Index文庫，按照5-Plex與TargetCap Core Exome Panel v3.0雜交16h，在 MGISEQ-2000平臺(tái)進(jìn)行150PE測(cè)序50Gb以上，隨機(jī)抽取10Gb進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控。

圖2. TargetCap Core Exome Panel v3.0測(cè)試實(shí)驗(yàn)流程

測(cè)評(píng)結(jié)果

冗余數(shù)據(jù)低至2%

華大智造平臺(tái)保持著一如既往的低冗余度約~2%。這得益于華大智造平臺(tái) DNBSEQ的非線性擴(kuò)增技術(shù)，同樣的數(shù)據(jù)量10G下，MGISEQ-2000能夠獲得更高的平均測(cè)序深度，達(dá)到131x。換個(gè)角度說，如果要達(dá)到相同的測(cè)序深度，華大智造平臺(tái)可有效節(jié)省測(cè)序成本。

圖3. MGI平臺(tái)信號(hào)放大示意圖

99.8%超高目標(biāo)區(qū)域覆蓋率

目標(biāo)區(qū)域覆蓋率在MGISEQ-2000達(dá)到總體99.8%，LQ 99.7%，HQ 99.9%，高質(zhì)量樣本覆蓋率稍高于稍低質(zhì)量樣本。

99.4%超高0.2x Mean Depth覆蓋率

1.低深度區(qū)域占比

0.2x Mean Depth: 25個(gè)樣本在華大智造平臺(tái)的均值為99.4%，LQ和HQ樣本在MGISEQ-2000上分別表現(xiàn)為99.3%和99.6%。

0.5x Mean Depth: 25個(gè)樣本在華大智造平臺(tái)的均值為92.9%，LQ和HQ樣本在MGISEQ-2000上分別表現(xiàn)為92.5%和93.4%。

2.整體均一性（Fold 80）

華大智造平臺(tái)上Fold80值為1.44，在不同質(zhì)量樣本中差別不大。

數(shù)據(jù)表明，在WES的各項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)中，華大智造MGISEQ-2000的表現(xiàn)優(yōu)異。總結(jié)如下表：

CV低至0.1%

數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性至關(guān)重要，而本次測(cè)評(píng)也對(duì)以上指標(biāo)的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估。簡(jiǎn)單來說，就是測(cè)了以上指標(biāo)的CV值（變異系數(shù)，Coefficient of Variation），結(jié)果同樣令人驚喜。

對(duì)于總體25例樣本，除Duplication參數(shù)外，其他各項(xiàng)參數(shù)的CV值均控制在3.1%及以下，覆蓋率和0.2x Mean Depth覆蓋率更低至0.1%，數(shù)據(jù)表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性。至于冗余率（Duplication）的CV值達(dá)到13.5%，由于MGISEQ-2000的冗余率已經(jīng)低至2.2%，這個(gè)CV值可以忽略不計(jì)。

圖4. TargetCap Core Exome Panel v3.0各指標(biāo)CV值

在后續(xù)文章中，我們將給大家?guī)鞹argetCap Core Exome Panel v3.0在MGISEQ-2000平臺(tái)變異檢測(cè)方面的內(nèi)容，敬請(qǐng)期待。

華大智造MGISEQ-2000適配應(yīng)用

參數(shù)解釋

對(duì)于靶向測(cè)序數(shù)據(jù)的評(píng)估，冗余度和中靶率決定了有效數(shù)據(jù)，即平均測(cè)序深度，而覆蓋均一性則決定了有多少目標(biāo)區(qū)域能夠用于最終分析，F(xiàn)DA所批準(zhǔn)的全外產(chǎn)品Omics Core規(guī)定平均測(cè)序深度≥500x，0.2x Mean Depth≥95%（≥100x的目標(biāo)區(qū)域占比）。

和木桶效應(yīng)一樣，木桶夠高還不行（平均測(cè)序深度），能盛多少水取決于最矮的木板（0.2x Mean Depth）；除了最矮的木板，還有一些木板稍高，他們就是0.3、0.4、0.5…x Mean Depth等，對(duì)于體細(xì)胞突變分析，當(dāng)然是“多多益善”，即更多的區(qū)域達(dá)到更深的測(cè)序深度，因此0.3-1.0x Mean Depth的值越高越好。

圖5. 靶向測(cè)序評(píng)估參數(shù)示意圖

除此之外，還有一個(gè)評(píng)估均一性的參數(shù)叫Fold 80，計(jì)算公式為平均深度/80%以上目標(biāo)區(qū)域覆蓋的深度，低于2.0均一性較好，可以理解成評(píng)估整個(gè)決口的大小。

*以上評(píng)測(cè)結(jié)果來自伯科生物

參考文獻(xiàn)

[1] Reinert T , Henriksen T V , Christensen E , et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J]. JAMA Oncology, 2019, 5(8).